A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋简短
剧中：迄今正蹂躏全球的新型冠状染病原染病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个发达国家和地区大广为流传，截至 2021 年 4 年初已导致最多 1.28 亿人染病毒感染，最多 280 万人失踪。举例来说，尚无可必要减低 COVID-19 被害率的治疗方法有。我们归纳了一种宗教性的之药材口服制剂——生发肺毒口服液 (RDS) 的潜在外用冠状染病原活性，该口服液主要氢氧化钠为东方医学宗教性之中运用于治疗气管癌症的之中之中药材。
结果：RDS 诱发 SARS-CoV 比较慢染病原、SARS-CoV-2 比较慢染病原、混和甲型染病原-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型染病原以及传染性 SARS-CoV-2 和新创的 Ha-CoV-2 兰花染病原 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶酶质的染病毒感染。我们全面展示出 RDS 可以直接灭活 SARS-CoV-2 染病原外层的传染性。此外，我们注意到 RDS 还可阻碍甲型甲型染病原对靶酶质的染病毒感染。
推论：RDS 可最常诱发溃疡染病原染病毒感染。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状染病原，外用染病原治疗，生发肺毒口服液，宗教性之药材，SARS-CoV，甲型甲型，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型染病原
▋剧中
迄今正蹂躏全球的新型冠状染病原染病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个发达国家和地区大广为流传，截至 2021 年 4 年初已导致最多 1.28 亿人染病毒感染，最多 280 万人失踪。举例来说，尚无可必要减低 COVID-19 被害率的治疗方法有。新不止现的 COVID-19 染病原染病原体为冠状染病原 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在具体情况严重急性呼独脚syndrome无关冠状染病原各种类型之中的姊妹染病原[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在之中国注意到的；SARS-CoV 染病原于 2002 年 11 年初在江门市首次被注意到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年初在武汉首次被注意到[1,7,8]。在之中国，这两次由冠状染病原引起的疫情之中，之药材以外被最常运用于，用以紧急状况应对冠状染病原引起的癌症。对于举例来说的 COVID-19 大广为流传，之中国有最多 85% 的 SARS-CoV-2 染病毒感染患者给予了宗教性之中医药医学上（9，10）。许多运用于的之药材是否有着必要的外用冠状染病原特性并在外科上是否必要，这个举足轻重弊端尚并未得不到充分回信。
之药材作为治疗冠状染病原所引发癌症的必要医学上，但由于欠缺体液或肾脏的系统归纳，其转型与恰当运用于以外受到了阻碍。为了明确之药材的潜在外用 SARS-CoV-2 活性，我们从常用之药材之中挑选了多种之中药材杀菌剂，并从之药材口服液 RDS(新泽西州一种商业化食品补充剂) 之中注意到了外用 SARS-CoV 和外用 SARS-CoV-2 染病原的活性，一种在新泽西州的商业食品补充剂。RDS 运用于强化人体性癌症的总体卫生，其还包括多种之中药材氢氧化钠，如药材和荆芥，它们是宗教性上运用于依靠炎症和气管癌症的之中之中药材 (11-13)。在此，我们引述 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假染病原以及有着染病毒感染性的野生型 SARS-CoV-2 染病原对靶酶质的染病毒感染有着中枢神经。我们全面证明 RDS 可通过直接灭活染病原外层或阻挡染病原侵入而诱发染病原的更早染病毒感染时程。此外，我们注意到 RDS 还可以阻挡甲流染病原对靶酶质的染病毒感染。这些相比之下，RDS 对溃疡染病原的染病毒感染有可能有着最常的中枢神经。
▋结果
为了从宗教性之中之中药材之中找到潜在的外用 SARS-CoV-2 活性，我们从近四十种宗教性之中药材之中挑选提取不止 SARS-CoV-2S 酶假型比较慢染病原[14,15] 和人体气管 A549(ACE2) 靶酶质，此本能 ACE2 等位基因会通过比较慢染病原转导作为表征介导，从而稳定转导来实现超传达。比较慢假型染病原运用于红色荧光酶 (GFP) 或荧光素酶 (Luc) 作为引述等位基因，并通过了有着广谱外用染病原进入诱发剂，以及的卡多尔 (Arbidol)[16]，和本能外用毒血清对外用 SARS-CoV-2(示意图 1a、C) 的验证。我们很难成功检查到的卡多尔 (Arbidol) 和外用毒血清对于 SARS-CoV-2 假型染病原的中枢神经，这是我们在其他四十余种宗教性之中药材杀菌剂试验中中之中无法注意到的，最主要其之中一些共存较高危险性的之中药材 (示意图 1a-C)。然而，鉴于比较慢性假型染病原非常少能检查 SARS-CoV-2 染病原的侵入暴力行为，我们不用回避这些之中药材杀菌剂有可能有在进入后阶段性很难诱发 SARS-CoV-2 的有可能性。我们全面从宗教性口服生发肺毒口服液 (RDS) 之中挑选不止了有可能的外用 SARS-CoV-2 活性，该产品线内则有九种之中药材氢氧化钠——、连翘、药材、荆芥、柴胡、苦杏仁、蜂房、皂角、醋，在之中国宗教性上运用于治疗气管癌症 (11-13)。
内则有苯基饮品酸、3，4-二邻饮品酰高纯度酸、苯基 3，4-二邻饮品酰高纯度酸、原儿茶酸、苯基绿原酸和木犀草素；花蕾之中还内则有生物碱 A、B 和 10 种已知环烯醚天冬氨酸生物碱[17]；该药用植物还内则有皂有机酸有机酸 A 和 B，以及外用炎症作用的生物碱 C[18,19]。连翘酯生物碱之中内则有木脂素、松脂醇和连翘生物碱[20]。药材之中内则有被称为药材药材的甾体药材，是药材属药用植物独有的药用植物化学物质[21,22]。榕荆芥之中主要活性氢氧化钠为四种单天冬氨酸，(−)-薄荷醇、(+)-普巴德醇、(−)-柠檬烯和 (+)-薄荷萘；这种药用植物还内则有其他化合物，如 1-辛烯-3-醇、3-辛醇、β-桃木烯和β-石竹烯[23]。柴胡内则有最多 162 种化合物，最主要环烯醚天冬氨酸和环烯醚天冬氨酸生物碱、苯丙生物碱、有机酸、天冬氨酸类、有机酸、黄醇类、和药材[24]。苦杏仁之中内则有紫杉、亚胺化合物和果胶胶原蛋白[25]。皂角刺之中内则有药材和羽扇豆酸[26,27]，而醋之中内则有主要活性氢氧化钠醋酸[28]。为了全面试验中中 RDS 的外用 SARS-CoV-2 活性，用多种不同酒精酸度的 RDS 函数调用 A549(ACE2) 酶质，然后让这些酶质在共存 RDS 的只能给予 4-6 不间断的染病毒感染。染病毒感染后，在不共存 RDS 的只能人才酶质，然后在 48 和 72 不间断的时候，通过流式酶质练成对染病原染病毒感染的中枢神经透过假设。为了依靠酶质危险性，运用于碲丙啶 (PI) 对即将失踪和已失踪的酶质透过切片，非常少在活酶质群之中归纳 GFP+酶质。如示意图 2 标明，我们仔细观察到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假染病原有着酸度诱发中枢神经。为了断定这些结果，我们运用于内源性传达 ACE2 的 VeroE6 酶质重复了该染病毒感染试验中中。
(可知下页示意图)
ACE2 内部传达，生产性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 染病原可对其透过染病毒感染，ACE2 多半运用于冠状染病原的归纳 (7)。考虑到在欠缺 ACE2 超传达 [15，29，30] 的只能，假型染病原对 VeroE6 的染病毒感染性较低，我们还运用于了荧光素酶引述等位基因假型染病原，该染病原的引述等位基因传达由 HIV-1LTR 和 Tat 特别设计，有着更高的引述等位基因敏感性和样本压缩。
示意图 2：RDS 诱发 SARS-CoV-2(GFP) 假型染病原染病毒感染 A549(ACE2) 酶质。
A.A549(ACE2) 酶质用 RDS 近十年酒精 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型染病原染病毒感染。将酶质浸去染病原和 RDS，并在不共存 RDS 的只能透过人才。流式酶质仪检查染病原染病毒感染诱发具体情况。并未染病毒感染的酶质和染病毒感染 SARS-CoV-2(GFP) 但擅自 RDS 治疗的酶质作为解读。GFP+酶质百分比已揭示。(PI) 碲丙啶。
B.RDS 的酶质危险性定量归纳。A549(ACE2) 酶质用 RDS 近十年酒精 4 不间断，浸去 RDS，无 RDS 人才 48 不间断。碲丙啶切片检查正要失踪酶质和已失踪酶质，流式酶质练氢氧化钠析。绘制酸度-自由基酶质危险性斜率，RDS 的半被害酸度 (LC50) 人口比例为 1:11.9。
如示意图 3A 标明，我们运用于 Luc 报告等位基因假染病原和 VeroE6 酶质透过染病毒感染试验中中，仔细观察到 RDS 对该染病原染病毒感染有着酸度诱发中枢神经，并且九成诱发酸度明确为 1:230RDS 酒精度 (示意图 3B)。我们还假设了 RDS 对 VeroE6 酶质活力的影响，明确了 50% 酶质失踪酸度为 1:11.8RDS 酒精度。
示意图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假染病原和野生型 SARS-CoV-2 染病原的酸度诱发诱发中枢神经。用 RDS 近十年酒精函数调用 A、BVeroE6 酶质，会用 SARS-CoV-2(Luc) 假型染病原染病毒感染。将酶质浸去染病原和 RDS，并在不共存 RDS 的只能透过人才。在染病毒感染后 72 不间断用荧光素酶检查染病原染病毒感染的中枢神经。并未染病毒感染酶质和 SARS-CoV-2-luc 染病毒感染但擅自过 RDS 治疗的酶质作为解读。试验中中重复三次。绘制酸度自由基斜率和 RDS 的 I-C50 酒精人口比例为 1:230。CRDS 对 VeroE6 酶质的酶质危险性也通过碲丙啶切片和流式酶质练成定量归纳。用 RDS 近十年酒精 4 不间断，浸去 RDS，在不则有 RDS 的只能人才 72 不间断。绘制酶质危险性酸度-自由基斜率，RDS 的半被害酸度 (LC50) 人口比例为 1:13.8 酒精。DRDS 诱发传染性 SARS-CoV-2 染病毒感染。用近十年酒精的 RDS 函数调用 VeroE6 酶质，并在 RDS 共存的只能染病毒感染 SARS-CoV-2。染病毒感染 48 不间断后，通过毒菌斑归纳染病原释放后的染病原拷贝诱发具体情况。诱发试验中一式共五透过，并在 Prism7(Graph Pad) 之中运用于单向方差 (One-Way ANOVA) 归纳及 Dunnett 后检查 (Dunnett's Post Test)，借以明确汇总显着性。异质性值用示意图例声称如下：*p
为了全面验证运用于假染病原赢得的结果，我们试验中中了 RDS 对于 SARS-CoV-2 染病毒感染的阻碍传染性潜能。如示意图 3D 标明，RDS 同时也阻碍了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 酶质的染病毒感染。RDS 在酒精 1:40 以上时可显著减小染病原深褐色的形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假染病原与传染性染病原的相比之下，RDS 内则有诱发 SARS-CoV-2 染病毒感染的活性氢氧化钠，有可能是通过直接灭活染病原或阻碍染病原的更早染病毒感染时程。
为全面归纳有可能的组态，我们将传染性 SARS-CoV-2 染病原外层与近十年酒精的 RDS 在 37°C 下预人才 1 不间断。随后，将氢氧化钠全面依次酒精-(10–1 至 10–4)，并投身于 Vero 酶质透过毒菌斑归纳以明确染病原染病毒感染性的减低。如示意图 4A 标明，我们仔细观察到在 RDS 之中直至去除一不间断后的染病原外层，其 SARS-CoV-2 的染病毒感染效价也椭圆形酸度诱发下降。该结果断定了 RDS 可必要直接灭活 SARS-CoV-2 染病原外层的传染性。
我们全面试验中中了 RDS 是否也能诱发 SARS-CoV-2 染病原兰花的染病毒感染。为此，我们利用值得注意开发的混和甲染病原-SARS-CoV-2 假型染病原 (Ha-CoV-2)[31] 来氢氧化钠一复刻版 S 酶类似于，最主要荷兰类似于 (B.1.1.7)，南非类似于 (B.1.351)，巴西类似于 (P.1)，北卡罗来纳州类似于 (B.1.429)，和其他几个新兴类似于 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和无关 S 酶变异体在 37°C 近十年酒精 RDS 人才 1 不间断。随后，用该氢氧化钠染病毒感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶酶质。染病毒感染后 12 不间断，荧光素酶测定染病原染病毒感染的中枢神经。如示意图 4B 标明，我们还仔细观察到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 酶类似于的酸度诱发诱发。
我们还试验中中了 RDS 阻碍 SARS-CoV 染病毒感染的潜能，运用于带有 SARS-CoV 突刺酶的 GFP 引述等位基因比较慢染病原和[15] 伪酸度。我们将人 A549(ACE2) 酶质主要用途靶酶质，将其用复刻版酒精的 RDS 函数调用，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告等位基因假染病原染病毒感染 4-6 不间断。染病毒感染后在不则有 RDS 的只能人才酶质，流式酶质练成假设检查其对染病原染病毒感染的中枢神经。除此以外，运用于碲丙啶回避正要失踪与已失踪的酶质，非常少在活酶质群之中归纳 GFP+酶质。如示意图 5A 标明，我们仔细观察到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型染病原的中枢神经椭圆形酸度诱发。我们全面断定了这些结果，并假设了 RDS 介导的诱发与 Luc 引述等位基因 SARS-CoV 假型染病原，SARSCoV(Luc)。我们仔细观察到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的中枢神经椭圆形酸度性依赖，其半诱发酸度 (IC50) 为 1:70.88 酒精度 (示意图 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都运用于 ACE2 染病毒感染靶酶质，我们还试验中中了 RDS 的外用染病原活性是否非常少针对与 ACE2 有交互作用的冠状染病原。为此，我们检查了一种不无关的负链 RNA 染病原---甲型甲型染病原。它通过染病原血凝素 (HA) 和酶质α-唾液酸来染病毒感染靶酶质。为了氢氧化钠甲型甲型染病原，将传达甲型甲型 A/WSN/33(H1N1) 等位基因组每个片断的 8 个表征和一个 GFP-引述等位基因共转染到 HEK293T 酶质之中。在 RDS 共存的只能，得来染病原外层并运用于染病毒感染远距离 MDCK 酶质。如示意图 6A 标明，我们仔细观察到 RDS 对甲型甲型染病原的中枢神经椭圆形酸度诱发。RDS 在 1:40 和 1:80 酒精时可实质上阻碍染病原染病毒感染，在 1:160 酒精MLT-可部分诱发甲型甲型。RDS 对 MDCK 酶质的半被害酸度 (LC50) 经测定为 1:18.5(示意图 6B)。这些相比之下，RDS 的外用染病原活性并非针对特定染病原，而有可能很难最常诱发多种溃疡染病原，如冠状染病原和甲型甲型染病原。
▋讨论
在本报告之中，我们展示出宗教性口服生发肺毒口服液 (RDS) 内则有广谱外用染病原活性，可阻碍 SARS-CoV、SARSCoV-2 和甲型甲型染病原的染病毒感染。虽然 RDS 很难诱发多种染病原，但其外用染病原活性因染病原类型和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 比较慢假染病原的 I-C50 酸度为 1:7.9 酒精度，对 SARS-CoV-2 比较慢假染病原的 I-C50 酸度为 1:230 酒精度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 染病原，I-C50 为 1:40 酒精度，对甲型甲型，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其兰花有多种不同的中枢神经，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 酒精度多于 (示意图 4B)。
(可知下一页示意图)
示意图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和新创的 Ha-CoV-2 兰花有着酸度诱发灭活作用。ASARS-CoV-2 外层加近十年酒精的 RDS 在 37°C 下人才 1 不间断。随后，将氢氧化钠全面近十年酒精，并投身于 Vero 酶质之中透过毒菌斑归纳，以明确染病原染病毒感染性减低。诱发试验中一式共五透过，并在 Prism7(GraphPad) 之中运用于单向方差 (One-WayANOVA) 归纳和 Dunnett 后检查 (Dunnett'sPostTest) 借以明确汇总显着性。异质性值用示意图例声称如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和无关 S 酶类似于与近十年酒精的 RDS 在 37°C 人才 1 不间断后，用氢氧化钠染病毒感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶酶质。染病毒感染后 12 不间断，荧光素酶测定染病原染病毒感染的中枢神经。RDS 的 IC50 值的酒精度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们全面展示出 RDS 可以诱发冠状染病原的更早染病毒感染时程。虽然具体的外用染病原组态尚并未清楚，但 RDS 可以通过直接灭活染病原外层或通过阻挡染病原侵入或阻碍染病原侵入后的更早时程来阻挡染病原染病毒感染。在其他几种宗教性之药材之中也注意到了外用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活性。例如，一种常可知的宗教性之药材——醋。
醋根之中已证明内则有醋酸素，可诱发 SARS 染病原[32] 外科分离株的拷贝。此外，另一种可运用于治疗溃疡癌症的之药材——双黄连制剂，已揭示不止在肾脏以酸度诱发方式诱发 SARS-CoV-23CL 酶酶 (3CLpro) 活性。悬钩子生物碱和悬钩子素拟作为双黄连阻碍 3CLpro[33] 的必要氢氧化钠。
示意图 5 RDS 诱发 SARS-CoV 假型染病原对 A549(ACE2) 酶质的染病毒感染。用近十年酒精的 RDS 函数调用 A、B 酶质，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型染病原染病毒感染。将酶质清浸，改成染病原和 RDS，在不共存 RDS 的只能透过人才。在染病毒感染后 48 不间断和 72 不间断，通过流式酶质练成或荧光素酶检查来定量归纳染病原染病毒感染的中枢神经。试验中中重复三次。绘制酸度拥护斜率，并绘制 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 酒精度 (C)
示意图 6 RDS 诱发甲流染病原对 MDCK 酶质的染病毒感染。(A) 用近十年酒精的 RDS 函数调用 MDCK 酶质 30 分钟，然后用甲流染病原 (GFP) 对其透过染病毒感染。染病毒感染后，在 RDS 共存下人才酶质。36 不间断后用流式酶质仪对染病原染病毒感染的中枢神经透过定量归纳。把并未染病毒感染的酶质与被甲流染病原 (GFP) 染病毒感染但擅自 RDS 管控的酶质透过对比。示意图之中揭示了 GFP+酶质的百分比。PI 声称碲丙啶 PI。
(B) 另外还运用于了 MTT 测定法定量归纳了 RDS 对 MDCK 酶质的危险性，绘制了酶质危险性的酸度-自由基斜率，经近似值，RDS 的九成被害酸度为 1:18.5 酒精度 RDS 的必要外用染病原氢氧化钠尚并未明确。然而，RDS 多种不同于悬钩子生物碱和悬钩子素，RDS 可以通过直接灭活染病原原子核来阻碍染病原染病毒感染 (示意图 4)，而悬钩子生物碱和悬钩子素则在染病原一段时间内的初期通过阻碍染病原酶酶的活性来发挥作用。然而，RDS 的肾脏外用 SARS-CoV-2 活性仍需在今后的鸟类归纳和本能外科试验中之中得不到断定。迄今，我们正要透过小型鸟类试验中中，以明确 RDS 在体液阻碍 SARS-CoV-2 染病原染病毒感染的潜质。
▋推论
我们的归纳表明，RDS 可最常诱发溃疡染病原的染病毒感染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和甲型甲型。
▋方法有
酶质和酶质人才
HEK293T (ATCC 巴里吉尔，两匹里兰州) MDCK (ATCC 巴里吉尔，两匹里兰州)，VeroE6 (ATCC 巴里吉尔，两匹里兰州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 获赠，巴里吉尔，两匹里兰州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 获赠，巴里吉尔，两匹里兰州) 迄今保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific) 内则有 10% 波灭活 FBS 和 1×青霉素-科里 (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 酶质人才基之中分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的酸度投身于嘌呤霉素和潮霉素 B。
细胞核转染和染病原氢氧化钠
则有 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的比较慢性假型染病原外层由 Virongy LLC (Manassas，VA) 透过，或按照后面所述的方法有[15] 氢氧化钠。简言之，为了氢氧化钠 GFP 引述等位基因比较慢性假染病原，HEK293T 酶质与传达 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的表征、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产不止荧光素酶引述等位基因比较慢性假型染病原，将 HEK293T 酶质与传达 SARSCoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的表征、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 透过共转染。转染后 48 不间断得来染病原上清液，离心浓缩，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 染病原 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 透过。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告等位基因细胞核和 A/WSN/1933 H1N1 新创细胞核 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 博士友好透过。在甲型染病原 A-GFP 引述等位基因原子核氢氧化钠之中，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 酶质 (ΔAT6)。48 不间断后得来染病原上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 传达表征购自 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 人工合成了 Ha-CoV-2(Luc) 表征和 S 酶变异表征。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶变异原子核按照后面所述方法有[31] 透过氢氧化钠。
染病原染病毒感染和口服诱发试验中
RDS(生发肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 获赠，利斯堡，两匹里兰州) 是由两匹博士试验中中室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业产品线。RDS 之中所有之中之中药材氢氧化钠以外符合《之中国药典 2015 年版》「饮片」标准，最主要必要氢氧化钠则有量比及重金属、农药普通版检查。RDS 是一种之药材的共煎剂，再次次产物在真空前提条件下水蒸气。SARS-CoV-2 外用血清由 LanceA. Liotta 医生透过。将的卡朵尔盐酸盐 (Sigma) 再泥浆在二苯基亚砜 (Sigma) 之中。对于假型染病原染病毒感染，12 孔板之中的 A549(ACE2) 酶质 (来自 Virongy LLC 获赠，巴里吉尔，两匹里兰州) 或 VeroE6 酶质用 RDS 函数调用 30 分钟，在 37℃ 下染病毒感染 4-6 不间断，然后在新鲜人才基之中浸涤人才 48-72 不间断。对于 VeroE6 酶质的染病毒感染，酶质也被 CoV-2 假型染病原染病毒感染强化剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 获赠，巴里吉尔，两匹里兰州) 函数调用后，在 37°C 下再次管控 30 分钟。运用于 GloMaxDiscover 酶标仪 (Promega) 归纳酶质裂解物的荧光素酶活性。对于野生型 SARS-CoV-2 染病毒感染，VeroE6 酶质在 37°C 下用 RDS 函数调用 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 染病毒感染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在爱德华梅森大学的 BSL-3 救助交通设施内停留 1 不间断。酶质用 PBS 浸涤 2 次，用则有 RDS 的人才基人才 48 不间断。从上清之中提取染病原，用 12 孔板人才的 Vero 酶质单层之中的毒菌斑试验中测定小瓶滴度。简言之，每个仪器在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 人才基 (VWR) 之中氢氧化钠，还包括 1X 青霉素-科里 (VWR)，并掺入 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种酒精液独脚附到 VeroE6 酶质单层的三个平行孔上 1 不间断。然后用 1～2 ml0.6% 培养基糖 (Invitrogen) 和一部分完整的 Eagle Minimal Essential 人才基 (VWR) 的氢氧化钠伸展单层，则有 1X 青霉素-科里，并掺入 10%FBS。48 不间断后，将单层膜比较简单在 10% 甲醛溶液之中 1 不间断，并去除伸展的培养基纳。为了切片深褐色，投身于内则有 20% 乙醇的 1% 结晶紫衍生物溶液 5 分钟，然后用去离子水浸涤。对于甲型甲型染病原染病毒感染 MDCK 酶质，在 37°C 下用 RDS 函数调用 30 分钟，然后用 A-GFP 引述等位基因染病原染病毒感染 6 不间断。用则有 RDS 的人才基浸涤酶质，人才 36 不间断。GFP 传达通过流式酶质仪定量归纳。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 染病原外层的 RDS 灭活试验中，将 100μl 近十年酒精的 RDS 掺入到 1 mlSARS-CoV-2 染病原原液 (3.65×105PFU/ml) 之中，再次次 RDS 酒精为 1:20，1:40 或 1:80。也最主要解读前提条件 (1 ml 染病原+100μl 人才基)。氢氧化钠在 37°C 下人才 1 不间断。随后，对氢氧化钠透过复刻版酒精以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 酒精度，并将近十年酒精的仪器投身于 12 孔板之中的 Vero 酶质之中，运用于透过毒菌斑测定归纳。深褐色测定之中再次次的 RDS 酒精度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 酒精液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶变异原子核按照后面所述的方法有[31] 氢氧化钠。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 近十年酒精的 RDS 掺入到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或类似于之中，再次次 RDS 酒精度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将氢氧化钠在 37°C 下人才 1 不间断，然后在 RDS 共存下染病毒感染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 酶质 12 不间断。运用于 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 归纳酶质裂解物的荧光素酶活性。
酶质危险性归纳检查
用碲丙啶切片和流式酶质练成假设对 A549 (ACE2) 酶质和 VeroE6 酶质的口服酶质危险性透过检查，如所述 (34)。运用于酶质增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建言的设计方案对 MDCK 酶质的口服危险性透过假设。简言之，将 MDCK 酶质 (ATCC) 以每孔 1×-105 个酶质的速度接种到 12 孔板之中。酶质人才隔夜后，通过 RDS 管控 1 天，然后在 MTT 标示试剂 (Sigma) 的人才基之中人才。将酶质与标示试剂协同人才 4 不间断，再次后续投身于 MTT 增溶液。人才皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 测定独脚光度。
缩写
SARS-CoV：具体情况严重急性性癌症综合症无关冠状染病原；SARSCoV-2：Severe 具体情况严重急性性癌症综合症无关冠状染病原-2；TCM：宗教性之药材；RDS：溃疡圣万桑口服液；Ha-CoV-2：混和甲型新冠染病原假染病原。
致辞
感激 FengLi 透过甲型染病原传达表征，感激 LanceLiotta 透过外用毒血清；感激 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与建言；感激 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 透过 RDS 和之中药材杀菌剂。
著者贡献
此次试验中中由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 内部设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 校对。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该试验中中。所有著者已阅读并批准再次次审阅。
资金不足
本归纳的经费来自于爱德华梅森大学内部捐助 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 透过。
样本和材料的可用性
本归纳之中产生或归纳的所有样本以外还包括在本文之中。试剂可从 Y.W 处获取。
声明
批准及作准备提议
不适用
提议不止版
不适用
竞争利益
爱德华梅森大学发达国家生物防御和狂犬染病之其中心的 RMH 和 YW 已赢得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的归纳资助，LAH 为德佳和畅担任顾问并赢得了佣金。无法其他联系或活动有可能会影响到提交的工作。
著者除此以外
1新泽西州两匹里兰州爱德华梅森大学系统生物学学院发达国家生物防御和狂犬染病之其中心，巴里吉尔 20110。
2VirongyLLC，两匹里兰州巴里吉尔。3渥太华伯纳比，BCV5J0E5 两匹博士试验中中室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 新泽西州两匹里兰州利斯堡世界卫生科学知识组织，20176。
收稿月份：2021 年 4 年初 7 日
给予月份：2021 年 5 年初 10 日
线上不止版时间：2021 年 5 年初 29 日
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校对： 翟超男相关新闻
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